Metabolomiczna analiza działania enalaprilu u dzieci z niewydolnością serca

Jak działa enalapril i dlaczego odpowiedź na terapię jest zmienna?

Enalapril, inhibitor enzymu konwertującego angiotensynę (ACE), jest szeroko stosowany w leczeniu nadciśnienia tętniczego i niewydolności serca u dzieci. Działa poprzez metabolizm wątrobowy do aktywnego metabolitu – enalaprilatu, który hamuje ACE, prowadząc do zmniejszenia tworzenia angiotensyny II i obniżenia wydzielania aldosteronu. W efekcie dochodzi do regulacji układu renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS), obniżenia ciśnienia tętniczego i zmniejszenia obciążenia następczego serca, co ostatecznie poprawia funkcję lewej komory serca.

U dorosłych obserwuje się znaczną zmienność międzyosobniczą w odpowiedzi na inhibitory ACE, zarówno pod względem parametrów fizjologicznych (np. ciśnienie tętnicze), jak i biochemicznych (np. markery RAAS). Pomimo stosowania tych leków, około 50% pacjentów z nadciśnieniem nie osiąga docelowych wartości ciśnienia. Ta zmienność w odpowiedzi na leczenie nie jest w pełni wyjaśniona, nawet po uwzględnieniu czynników potencjalnie wpływających na dystrybucję leku, takich jak choroby współistniejące, spożycie pokarmów czy rasa.

Metabolomika, czyli analiza małych cząsteczek w próbkach biologicznych, których stężenie odzwierciedla wszystkie procesy biochemiczne zachodzące w organizmie, jest coraz częściej wykorzystywana do zrozumienia zmienności odpowiedzi na leczenie. Metabolomika uwzględnia wiele źródeł zmienności, w tym te związane z genomem, transkryptomem i proteomem, co pomaga w zrozumieniu choroby i odpowiedzi na terapię. W populacji dorosłej badano różnice w odpowiedzi metabolomicznej na inhibitory ACE zależne od genotypu. Kilka dipeptydów uznano za potencjalne funkcjonalne markery aktywności ACE u dorosłych pacjentów, niezależnie od wskazania. Ponadto, metabolity mogły przewidywać słabą odpowiedź na lizynopryl – który również jest inhibitorem ACE – w leczeniu nadciśnienia lub były związane z aktywnością ACE. “Odkryte metabolity oferują wskazówki w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie i indywidualizacji terapii u dorosłych” – wskazują badacze.

Warto jednak podkreślić, że niewydolność serca u dzieci różni się od niewydolności u dorosłych pod względem etiologii, manifestacji klinicznej, chorób współistniejących i częstości występowania. Ponadto, u niemowląt i dzieci (do czwartego roku życia) obserwuje się zwiększoną aktywność RAAS. Dlatego wyniki badań u dorosłych nie mogą być po prostu ekstrapolowane na populację pediatryczną. Co istotne, do tej pory nie przeprowadzono badań metabolomicznych u dzieci leczonych inhibitorami ACE.

Jakie są kluczowe aspekty badania LENA?

W wieloośrodkowym, międzynarodowym badaniu prospektywnym fazy II/III (LENA) oceniano farmakokinetykę, farmakodynamikę i bezpieczeństwo enalaprilu u dzieci z niewydolnością serca spowodowaną wrodzoną wadą serca (CHD). Wyniki wykazały zmienność międzyosobniczą w odpowiedzi na leczenie. Podobnie jak badania metabolomiczne u dorosłych pomogły w rozwikłaniu odpowiedzi na leczenie inhibitorami ACE, celem obecnego badania było zbadanie potencjału profilowania metabolicznego w stratyfikacji pacjentów pediatrycznych z CHD pod względem odpowiedzi na leczenie, dążąc do indywidualizacji terapii.

Dodatkowo badano profile metaboliczne u zdrowych dzieci z grupy kontrolnej i porównywano je z profilami pacjentów z niewydolnością serca związaną z CHD, aby lepiej zrozumieć tę chorobę. Niewielka liczba badań pediatrycznych analizowała profile metaboliczne w różnych chorobach, a porównanie profili pacjentów ze zdrowymi kontrolami prowadziło do lepszego zrozumienia szerokiego spektrum chorób. Czy takie podejście może zaoferować możliwość identyfikacji biomarkerów diagnostycznych lub terapeutycznych? Badanie to miało na celu odpowiedzieć na to pytanie.

Badanie metabolomiczne było częścią wieloośrodkowego, międzynarodowego prospektywnego, otwartego badania pomostowego farmakokinetycznego fazy II/III u pacjentów z CHD (LENA). W skrócie, pacjenci byli leczeni nowo opracowanymi minitabletkami rozpraszającymi się w jamie ustnej (ODMT) enalaprilu i systematycznie oceniani pod kątem farmakokinetyki i farmakodynamiki, a także parametrów klinicznych. Do tego badania metabolomicznego mogły zostać włączone tylko dzieci z CHD w wieku 0-6 lat, których rodzice wyrazili konkretną zgodę na ten podbadanie.

Kryteria włączenia obejmowały rozpoznanie niewydolności serca z powodu CHD, potrzebę zmniejszenia obciążenia następczego przez terapię lekową oraz masę ciała większą niż 2,5 kg. Pacjenci musieli być nieleczeni wcześniej inhibitorami ACE lub już stosować inhibitory ACE, ale być gotowi do przejścia na ODMT enalaprilu. Wykluczono pacjentów stosujących podwójną terapię inhibitorami ACE, inhibitory reniny, antagonisty angiotensyny II i niesteroidowe leki przeciwzapalne. Wykluczono również pacjentów z ciśnieniem tętniczym poniżej piątego percentyla dla wieku. Pełna lista kryteriów włączenia i wyłączenia została wymieniona w protokole badania. Do badania należało włączyć co najmniej 60 pacjentów, w tym co najmniej 37 pacjentów poniżej 12 miesiąca życia, aby uzyskać odpowiednie dane farmakokinetyczne dla populacji pediatrycznej i dokładnie opisać zależność dawka-ekspozycja w tej populacji.

Dla tego badania metabolomicznego próbki kontrolne pobrano od zdrowych dzieci dopasowanych pod względem płci i wieku, przed jakimkolwiek drobnym zabiegiem medycznym lub chirurgicznym. Komisje etyki badań medycznych odpowiedzialnych ośrodków zatwierdziły protokół badania LENA (w tym podbadanie metabolomiczne). Obejmowało to Univerzitetska Dečja Klinika w Belgradzie, Serbia, Medizinische Universität w Wiedniu, Austria, Göttsegen Gyorgy Orszagos Kardiologiai Intezet HPHC w Budapeszcie, Węgry, Erasmus Medical Center w Rotterdamie, Holandia, Wilhelmina Kinderziekenhuis Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Utrechcie, Holandia, a także Great Ormond Street Hospital for Children, NHS Trust GOSH w Londynie, Wielka Brytania. Komisja etyki badań medycznych Erasmus Medical Center zatwierdziła protokół zbierania próbek od zdrowych kontroli. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od rodzin wszystkich uczestników przed włączeniem do badania.

Enalapril podawano doustnie w postaci ODMT, a przyjęcie dawki początkowej odbywało się w klinice. Pacjenci, którzy nie byli wcześniej leczeni inhibitorami ACE, byli poddawani stopniowemu zwiększaniu dawki zgodnie z określonym schematem, a pacjenci, którzy już przyjmowali enalapril, pozostawali na tej samej dawce po przejściu na ODMT enalaprilu.

Parametry kliniczne oceniane podczas wizyty z dawką początkową obejmowały skalę Rossa do dokładnej oceny obecności i ciężkości niewydolności serca u dzieci (zakres: 0-12), frakcję skracania (SF) na podstawie echokardiografii i nieinwazyjne średnie ciśnienie tętnicze. Krew pobierano w celu oceny aktywności RAAS (w tym reniny, angiotensyny I, aldosteronu i aktywności reniny w osoczu) przed podaniem i 4 godziny po podaniu enalaprilu. Ponadto zbierano pełną krzywą farmakokinetyczną z punktami pobierania próbek po 1, 2, 4, 6 i 12 godzinach po podaniu. Do analizy metabolomicznej krew pobierano przed podaniem enalaprilu.

Jak klasyfikujemy pacjentów i analizujemy wyniki?

Markery farmakodynamiczne i farmakokinetyczne, w tym renina, aktywność reniny w osoczu, angiotensyna I, stężenia enalaprilu i enalaprilatu, mierzono zgodnie z wcześniejszym opisem. W skrócie, stężenia enalaprilu i enalaprilatu określano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Farmakokinetykę enalaprilu i enalaprilatu charakteryzowało maksymalne stężenie w surowicy (Cmax), a także pole pod krzywą (AUC) od zera do nieskończoności. To AUC obliczono metodą trapezów z ekstrapolacją do nieskończoności. Reninę oznaczano za pomocą chemiluminescencyjnego testu immunologicznego opartego na przeciwciałach monoklonalnych. Aktywność reniny w osoczu i angiotensynę I oznaczano w radioimmunoologicznym teście 125I wykorzystującym przeciwciała przeciwko angiotensynie I i krążącą immunoreaktywną angiotensynę I. Aldosteron mierzono za pomocą wcześniej zwalidowanego testu immunologicznego. Ten test został zwalidowany w zakresie kalibracji aldosteronu między 43 a 958 pg/ml. Średnia różnica między oryginałem a powtórzeniem ponownej analizy próbki LENA wynosiła -4%.

Metabolity analizowano w surowicy za pomocą półilościowej spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości z bezpośrednim wstrzykiwaniem w połączeniu ze źródłem jonizacji nanoelektrosprejowej, jak opisano wcześniej. W skrócie, metabolity ekstrahowano z 7,5 µl surowicy poprzez dodanie 140 µl metanolu ze stabilnymi izotopowo znakowanymi standardami wewnętrznymi (acylokarnityny i aminokwasy). Ten roztwór wirowano przez pięć minut przy 17000 g, a supernatant rozcieńczano 45 µl 0,3% kwasu mrówkowego. Następnie filtrowano go za pomocą płytki filtracyjnej 96-dołkowej kondycjonowanej metanolem (Acro prep, 0,2 m GHP, NTRL, 1 ml dołek; Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA) i kolektora próżniowego. Filtrat próbki zbierano na płytce 96-dołkowej (Advion, Ithaca, NY, USA). Próbki (13 µl) wstrzykiwano w trzech powtórzeniach do wysokorozdzielczego spektrometru mas Q-Exactive za pomocą systemu TriVersa NanoMate (Advion, Ithaca, NY, USA) sterowanego oprogramowaniem Chipsoft (wersja 8.3.3, Advion).

Wysokorozdzielczy spektrometr mas Q-Exactive działał w trybie jonów dodatnich i ujemnych w jednym przebiegu, z automatycznym przełączaniem polarności. Były dwa segmenty czasowe 1,5 min z całkowitym czasem przebiegu 3,0 min. Zakres skanowania wynosił 70-600 stosunku masy do ładunku (m/z), rozdzielczość wynosiła 140 000 przy m/z = 200. Akwizycję danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Xcalibur (Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Za pomocą MSConvert15 (ProteoWizard Software Foundation, Palo Alto, CA, USA) pliki surowych danych zawierające czas skanowania, m/z i intensywność piku przekonwertowano do formatu mzXML. Przetwarzanie danych i wywoływanie pików przeprowadzono za pomocą opracowanego we własnym zakresie potoku (https://github.com/UMCUGenetics/DIMS).

Wykryte piki masowe zostały oznaczone przez dopasowanie m/z piku masowego z zakresem pięciu części na milion do mas metabolitów obecnych w Human Metabolome Database (HMDB). Wybrano adnotacje metabolitów bez jonów adduktów w trybie ujemnym lub dodatnim ([M – H]−,[M + H]+) lub z pojedynczymi jonami adduktów [M + Na]+, [M + K]+ i [M + Cl]−. Dla każdej próbki zsumowano intensywności tych pięciu pików masowych, co dało jeden (zsumowany) pik masowy intensywności na adnotację metabolitu: łącznie ~6600 zsumowanych pików masowych. Następnie wykluczono adnotacje metabolitów egzogennych i lekowych, co dało łącznie ~3900 zsumowanych pików masowych, odpowiadających ~1900 adnotacjom metabolitów (związków izobarycznych), ponieważ piki masowe mogą odpowiadać kilku izomerom.

Dla każdego piku masowego na próbkę pacjenta odchylenie od intensywności w próbkach kontrolnych wskazywano za pomocą wartości Z, obliczanej jako: wartość Z = (intensywność próbki pacjenta – średnia intensywność próbek kontrolnych) / odchylenie standardowe intensywności próbek kontrolnych.

Jakie cechy kliniczne wyróżniają responderów?

Pacjentów podzielono na responderów i nieresponderów na podstawie różnicy między poziomami aldosteronu przed i po dawce. Zrozumienie różnicy w odpowiedzi aldosteronu jest wartościowe, ponieważ jest to końcowy i bezpośredni efektor RAAS, a niezależnie od ciśnienia tętniczego, jego poziomy są związane z wynikami klinicznymi u dzieci. Ponieważ zahamowanie RAAS przez enalapril zwykle prowadzi do obniżenia poziomu aldosteronu, pacjentów zdefiniowano jako responderów, gdy ich poziom aldosteronu zmniejszył się po podaniu enalaprilu. Różnicy ciśnienia tętniczego po podaniu enalaprilu nie wykorzystano do kategoryzacji pacjentów, ponieważ dokładne pomiary ciśnienia u niemowląt są podatne na błędy, a zatem mniej wiarygodne.

Różnice między grupami oceniano za pomocą testu U Manna-Whitneya. W przypadku zmiennych ciągłych dane wyrażano jako wartości mediany z przedziałami międzykwartylowymi (IQR), gdy nie były normalnie rozłożone. Do porównania między markerami farmakokinetycznymi i farmakodynamicznymi przed i po podaniu zastosowano test rang Wilcoxona. Do wyświetlania zmiennych kategorycznych używano liczb i wartości procentowych. Analiza statystyczna odbyła się przy użyciu SPSS wersja 25.0.

Do analizy cech metabolomicznych wykorzystano MetaboAnalyst. Większość metabolitów to związki izobaryczne i nie mają unikalnych mas nominalnych. Przy spektrometrii mas z bezpośrednim wstrzykiwaniem związki te nie mogą być rozdzielone, a zatem jedna cecha może reprezentować jeden lub wiele metabolitów. Do wizualizacji i interpretacji różnic zastosowano zarówno analizę głównych składowych (PCA) (algorytm uczenia nienadzorowanego), jak i częściową analizę dyskryminacyjną najmniejszych kwadratów (PLS-DA) (algorytm uczenia nadzorowanego), mającą na celu odróżnienie responderów od nieresponderów oraz pacjentów od zdrowych kontroli.

Do selekcji cech, np. wyboru cech, które różniły się znacząco między dwiema grupami, zastosowano test t dla dwóch próbek na surowych danych. Dane nie były filtrowane, ponieważ liczba cech nie przekraczała 5000 i wszystkie cechy zostały uwzględnione w analizie. Nie korygowano dla wielokrotnych testów. Aby uzyskać jaśniejsze wyniki, dane były skalowane za pomocą autoskalowania (centrowane średnią i dzielone przez odchylenie standardowe każdej zmiennej). Zakładając równą wariancję grup, ponieważ wiele pomiarów biologicznych ma typowy wzorzec rozproszenia o rozkładzie normalnym, testy t dla dwóch próbek zostały użyte do określenia metabolitów interesujących do różnicowania między grupami.

Co wynika z analizy metabolomicznej u dzieci?

Dla wszystkich zidentyfikowanych ważnych cech zbadano związek ze chorobami sercowo-naczyniowymi dla zidentyfikowanego metabolitu, ale także dla jego związków izobarycznych. Na koniec, aby potencjalnie powiązać nieznane cechy metaboliczne, przeprowadzono analizę klastrów, aby ujawnić regulowane w górę lub w dół szlaki między grupami.

Surowe dane zostały opublikowane w MetaboLights, która jest bazą danych dla eksperymentów metabolomicznych i uzyskanych informacji. (Link pojawi się po akceptacji).

W badaniu LENA włączono łącznie 67 pacjentów, a wszyscy wyrazili zgodę na udział w tym badaniu metabolomicznym. Spośród tych 67 pacjentów, prawie połowa (n=31) miała zdiagnozowany ubytek przegrody przedsionkowo-komorowej (AVSD) (46%), 21 z ubytkiem przegrody międzykomorowej (VSD) (31%), trzech z niedomykalnością zastawki mitralnej (5%), jedenastu pacjentów miało różne rozpoznania w tym całkowity ubytek przegrody przedsionkowo-komorowej, dwuujściową prawą komorę, zespół niedorozwoju lewego serca, przetrwały przewód tętniczy i przełożenie wielkich naczyń. U jednego pacjenta rozpoznanie nie zostało zarejestrowane i nie można go było przypomnieć.

Próbki surowicy zostały zebrane, a dla 63 z tych pacjentów dostępne były poziomy aldosteronu (przed i po podaniu enalaprilu) i poziomy metabolitów (tylko przed podaniem). Na podstawie różnic między poziomami aldosteronu przed i po podaniu enalaprilu zdefiniowano responderów (n=41) i nieresponderów (n=22). Mediana zmiany poziomu aldosteronu wynosiła -144,3 (IQR -353,9 do -60,1 pg/ml) dla responderów, podczas gdy nieresponderzy mieli medianę zmiany 61,2 (28,4-210,4) pg/ml.

Obie grupy pacjentów miały podobne wyjściowe charakterystyki przed terapią enalaprilem. Wyniki w skali Rossa obu grup wskazują na łagodną niewydolność serca, podczas gdy SF mieści się w normalnym zakresie pediatrycznym (między 29% a 46%, niższe wartości procentowe wskazują na gorszą funkcję lewej komory). Po podaniu enalaprilu, cztery godziny po dawce, wystąpiło równomierne obniżenie ciśnienia tętniczego u responderów (mediana -3,3, IQR -9,5 do 1,3 mmHg) i nieresponderów (mediana -5,3, IQR -12,1 do 6,8 mmHg) (test rang Wilcoxona, p = 0,005 i p = 0,042, odpowiednio). Choć statystycznie nieistotne, mediana początkowych poziomów aldosteronu była wyższa u responderów [576 (IQR 249-965) pg/ml] w porównaniu z nieresponderami [434 (IQR 94-731)] (p = 0,055).

Próbki kontrolne pobrano od 46 dzieci o medianie wieku 97 (IQR 63-160) dni, co było równe medianie wieku pacjentów [132 (IQR 54-211) dni] (test U Manna-Whitneya, p = 0,306).

W analizie metabolomicznej najpierw przeanalizowano profile metaboliczne u pacjentów i zidentyfikowano łącznie 1820 unikalnych cech. Nienadzorowana PCA nie wykazała dwóch wyraźnych klastrów osób. Stosując PLS-DA, responderzy i nieresponderzy różnili się znacząco. Test t dla dwóch próbek ujawnił 94 istotnie różne cechy (próg wartości p 0,05) między responderami a nieresponderami, z których 15 najważniejszych (posortowanych według najwyższej wartości t) zostało zwizualizowanych na Rysunku 1C (pełna lista zidentyfikowanych cech z odpowiadającymi związkami izobarycznymi wymieniona w Tabeli Uzupełniającej S1, posortowana według wartości t).

Następnie porównano profile metaboliczne pacjentów ze zdrowymi kontrolami. Tutaj PCA ujawniła dwa wyraźne klastry osób (Rysunek 2). Używając ponownie testu t dla dwóch próbek, ujawniono 278 unikalnych cech (próg wartości p 0,001), wymieniając najbardziej charakterystyczne cechy na Rysunku 2 (pełna lista cech z odpowiadającymi związkami izobarycznymi w Tabeli Uzupełniającej S2). Analiza klastrów nie ujawniła (grup) szlaków, które były regulowane w górę lub w dół i mogły wyjaśnić różnice między grupami.

To badanie metabolomiczne u dzieci z niewydolnością serca związaną z CHD zostało zaprojektowane w celu identyfikacji metabolitów, które odróżniają pacjentów odpowiadających na terapię enalaprilem na podstawie poziomu aldosteronu od pacjentów, którzy nie odpowiadają. “Nasze nietargowane podejście metabolomiczne zidentyfikowało charakterystyczny profil metaboliczny dla pacjentów odpowiadających na terapię enalaprilem” – podkreślają autorzy badania. Jako cel drugorzędny oceniono różnicę w profilach metabolicznych pacjentów i zdrowych kontroli dopasowanych wiekowo, aby lepiej zrozumieć patofizjologię niewydolności serca związanej z CHD. Analiza wykazała wyraźną różnicę między pacjentami a zdrowymi kontrolami na podstawie ich profili metabolicznych.

Niektóre z metabolitów związanych z odpowiedzią na terapię enalaprilem były wcześniej powiązane z cięższymi chorobami sercowo-naczyniowymi w innych kohortach (Tabela 2). Obejmuje to kwas oleinowy, argininę, prostaglandynę F2a i treoninę, które były wszystkie wyższe u responderów w porównaniu z nieresponderami. Kwas oleinowy był związany z cięższą niewydolnością serca, a także ze zwiększonym poziomem angiotensyny II u otyłych dorosłych z nadciśnieniem. Ponadto, interakcja między kwasem oleinowym a angiotensyną II prowadziła do niższej żywotności komórek i zwiększonej liczby małych komórek mięśni naczyniowych. Ponieważ wyższe poziomy kwasu oleinowego i angiotensyny II są obecne u pacjentów z wyższym wynikiem ryzyka sercowo-naczyniowego, Greene i wsp. postawili hipotezę, że kwas oleinowy i angiotensyna II mogą wchodzić w interakcje, aby przyspieszyć chorobę naczyniową u otyłych pacjentów z nadciśnieniem.

Ponadto, arginina i prostaglandyna 2a były związane z (cięższą) niewydolnością serca. Istnieją wyższe stężenia argininy w surowicy i zmniejszona produkcja tlenku azotu w mięśniu sercowym, a także zwiększone poziomy prostaglandyny F2a i treoniny u pacjentów z niewydolnością serca. Również, chociaż nieistotne statystycznie, markery farmakodynamiczne RAAS były wyższe u responderów w porównaniu z nieresponderami (p = 0,055-0,272) przed podaniem enalaprilu, sugerując zwiększoną aktywację RAAS u tych pacjentów. Ponieważ RAAS jest aktywowany u pacjentów z wysokim ryzykiem sercowo-naczyniowym, wraz z wyżej wymienionymi skojarzeniami dla metabolitów, może to wskazywać, że pacjenci odpowiadający na terapię enalaprilem mogli być bardziej poważnie chorzy.

Definicja responderów oparta na pojedynczym nieprawidłowym poziomie aldosteronu po dawce inhibitora ACE może stanowić ograniczenie naszego projektu badania. Po znaczącym okresie terapii niewydolności serca mogą wystąpić alternatywne szlaki tworzenia aldosteronu, znane jako teoria ucieczki aldosteronu. Jednak uważamy, że w naszej populacji, w której większość pacjentów nie była leczona z powodu niewydolności serca przez długi okres, aldosteron jest nadal głównym identyfikatorem odpowiedzi na leczenie.

Chociaż wyniki w skali Rossa i SF były równe między responderami a nieresponderami, te klasyfikacje mają ograniczenia. Stosowanie skali Rossa nadal wymaga walidacji jako zastępczy punkt końcowy kliniczny w dużej liczbie pacjentów, co osłabia jego obecną wartość dla oceny ciężkości niewydolności serca u dzieci. Ponadto, określenie SF opiera się na normalnym kształcie lewej komory, który może być zmieniony w obecności wrodzonych wad serca. Zatem mniej wyraźne różnice w ciężkości choroby mogą bardzo dobrze istnieć między grupami, mimo że wyniki w skali Rossa i SF wskazywały tylko na łagodną niewydolność serca.

Jednak nie wszystkie metabolity potwierdzają to ustalenie. Glutamina, która była wyższa u responderów, promowała zdrowie sercowo-naczyniowe poprzez wywieranie działania przeciwutleniającego i przeciwzapalnego, a także poprzez optymalizację syntezy tlenku azotu u dorosłych. Zgodnie z tym, u dorosłych pacjentów z niewydolnością serca poziomy glutaminy były niższe. W przypadku histydyny i cytruliny dostępne dane są sprzeczne, sugerując zarówno negatywny, jak i pozytywny związek z niewydolnością serca. Żadna z innych cech odróżniających responderów od nieresponderów nie była związana z chorobą sercowo-naczyniową lub RAAS.

Interesujące jest to, że chociaż nienadzorowane uczenie wyraźnie oddzieliło pacjentów z CHD od kontroli, żaden z 15 najważniejszych zidentyfikowanych metabolitów nie miał znanego związku z chorobą sercowo-naczyniową, z wyjątkiem aldosteronu, który był niższy u pacjentów. Ponieważ 50% wszystkich pacjentów było wstępnie leczonych inhibitorami ACE przed rozpoczęciem terapii enalaprilem, może to wyjaśniać niższe poziomy aldosteronu u pacjentów w porównaniu z kontrolami. Wszystkie inne ważne cechy (top 15) nie były wcześniej powiązane z chorobą, z wyjątkiem glukozylosfingozynu, który był znacząco niższy u pacjentów. Jest to dobrze znany marker choroby Gauchera, rzadkiego zaburzenia genetycznego, w którym sfingolipidy gromadzą się w komórkach, prowadząc do dysregulacji immunologicznej i choroby szkieletowej. Jednak dlaczego poziomy glukozylosfingozynu są wyższe u naszych pacjentów pediatrycznych, wymaga dalszego badania.

Chociaż 15 najważniejszych cech nie ma znanego związku z chorobą sercowo-naczyniową, inne cechy dalej na liście były wcześniej związane z (cięższą) niewydolnością serca. Wiele badań metabolomicznych u dorosłych pacjentów z niewydolnością serca ujawniło dużą liczbę zaburzonych metabolitów, które mogłyby być potencjalnymi biomarkerami. Wiele z raportowanych metabolitów, które były związane z (cięższą) niewydolnością serca, było również wyższych u naszych pacjentów niż u kontroli (izoleucyna, arginina, betaina, prolina, kreatyna i karnityna (Tabela 2). Na przykład, kreatyna będzie podwyższona w przypadku uszkodzenia mięśni i była wyższa u pacjentów w porównaniu z kontrolami. Czy można to przypisać uszkodzeniu mięśnia sercowego? Nie jest to jasne. Ponownie, w przypadku glutaminy, która była wyższa u naszych pacjentów, poziomy były niższe u pacjentów z niewydolnością serca w porównaniu ze zdrowymi kontrolami. Chociaż poziomy glutaminy są znacząco niższe u dzieci w porównaniu z dorosłymi, nie może to wyjaśnić zaobserwowanych różnic.

Według wiedzy autorów, jest to pierwsze badanie raportujące profile metabolomiczne u dzieci poddanych terapii inhibitorami ACE. Trzy badania metabolomiczne przeprowadzono u dzieci z niewydolnością serca. Correia i wsp. badali profile metaboliczne 28 dzieci poddawanych operacji z powodu CHD. Miały one medianę wyniku w skali Risk Adjustment for Congenital Heart Surgery (RACHS) wynoszącą 2 (IQR 2-3), przy czym 6 jest najwyższym, a 1 najniższym możliwym wynikiem. Pacjenci byli nieco starsi niż w naszej kohorcie (mediana wieku 6,6 miesiąca, IQR 4,0-18,9 miesiąca) i ciężej chorzy. Bezpośrednio po operacji pacjenci mieli niewydolność wielonarządową [mediana wyniku Pediatric Logistic Organ Dysfunction II (PELODII) 11 (IQR 11-20,75)]. Spośród 15 predefiniowanych metabolitów próbkowanych przed operacją, osiem metabolitów (3-d-hydroksymaślan, aceton, acetooctan, cytrynian, mleczan, kreatyna, kreatynina i alanina) było związanych z pooperacyjnymi wynikami PELODII i RACHS. Spośród tych metabolitów tylko kreatyna (nr 168) i kreatynina (nr 305) różnicowały naszych pacjentów od kontroli.

Dodatkowo, spośród 521 predefiniowanych metabolitów, 44 metabolity odróżniały 26 pacjentów z chorobą jednej komory w wieku 2-19 lat od kontroli. Obejmowały one acylokarnityny, aminokwasy i kwasy żółciowe. Trzy z tych metabolitów również znacząco różniły się między pacjentami a zdrowymi kontrolami w naszej kohorcie: dodekanedioilokarnityna (nr 93) i dwa kwasy żółciowe; kwas taurocholowy (nr 155) i kwas glikocholowy (nr 146). Co ciekawe, podczas gdy poziomy kwasu glikocholowego i taurocholowego były wyższe, a poziomy dodekanedioilokarnityny niższe u pacjentów w porównaniu z kontrolami, zaobserwowaliśmy odwrotność.

Na koniec, u niemowląt poddawanych operacji z krążeniem pozaustrojowym, przed i po operacji, zmierzono 165 metabolitów w surowicy, mając na celu rozróżnienie między osobami, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły, a także przewidzenie długości pobytu na oddziale intensywnej terapii. Ci pacjenci mieli medianę wyniku Arystotelesa 10,0 (3,0-19,5), wskazującą na średnią złożoność dostosowaną do procedury (wynik waha się między 1,5 a 25). Wiele szlaków wykazało zmiany między grupami, jednak żaden z ich 15 najważniejszych metabolitów nie pasował do naszych wyników. Podsumowując, patrząc na te trzy badania pediatryczne, istnieje tylko niewielkie nakładanie się między zidentyfikowanymi ważnymi cechami. Może to być spowodowane różnicami w wieku, rozpoznaniu lub ciężkości choroby, ponieważ czynniki te są dobrze znanymi wpływami na metabolom.

Chociaż badania metabolomiczne u dzieci stosujących inhibitory ACE nie są dostępne, efekt inhibitorów ACE na metabolom był badany u dorosłych. W populacyjnym badaniu metabolomicznym zbadano 517 metabolitów u 1361 osób, a wyniki zreplikowano w innej kohorcie opartej na 1964 osobach. Pacjenci stosujący inhibitory ACE zostali wybrani niezależnie od wskazania do stosowania inhibitorów ACE. Istniały różnice w stężeniach pięciu dipeptydów i trzech stosunków di- i oligopeptydów między użytkownikami inhibitorów ACE a osobami niestosującymi. Dwa z tych dipeptydów (aspartylfenyloalanina i fenyloalaniloseryna) wykazały nawet znaczące związki z odpowiedzią ciśnienia tętniczego i tym samym kwalifikowały się jako odczyty aktywności ACE. Jednak te metabolity nie były uważane za ważne cechy w naszej kohorcie, ani do odróżnienia responderów od nieresponderów, ani do rozróżnienia między pacjentami a kontrolami. Również 2-oksoglutaran, który przewidywał odpowiedź na lizynopryl u dorosłych pacjentów z nadciśnieniem, nie został uwzględniony na naszych listach ważnych cech. Prawdopodobnie można to wyjaśnić różnicami demograficznymi i różnymi wskazaniami do stosowania inhibitorów ACE (nadciśnienie vs. niewydolność serca).

Chociaż nasze badanie dostarcza nowych informacji na temat zaburzeń metabolicznych u dzieci z CHD stosujących enalapril, istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, wielkość próby jest stosunkowo mała, z 63 pacjentami i 46 kontrolami. Ze względu na złożoność badań metabolomicznych, obecnie nie ma standardowych metod określania wielkości próby. Niemniej jednak, w porównaniu z istniejącymi kohortami badającymi metabolom w populacji pediatrycznej, uważamy, że nasze badanie obejmowało wystarczającą liczbę pacjentów. Ponadto ma ono zaletę wąskiego zakresu wiekowego włączonych pacjentów. Również prowadzenie większego badania obejmującego podobną populację jest wyzwaniem, ponieważ częstość występowania pacjentów z CHD stosujących inhibitory ACE jest stosunkowo niska, a wysokiej jakości pobieranie próbek i analiza markerów RAAS jest trudna w warunkach klinicznych.

Ponieważ krew do analizy metabolomicznej u kontroli została pobrana po tym, jak dzieci te zostały uspokojone przed niewielkim zabiegiem chirurgicznym, można to uznać za kolejne ograniczenie. Mimo że kontrole były zdrowe i dopasowane wiekowo, mogłoby wystąpić zniekształcające działanie sedacji, którą otrzymały. Najczęściej znieczulenie było indukowane sewofluranem lub propofolem/fentanylem, których wpływ na metabolom ogólnoustrojowy jest nadal niepewny. U 500 dorosłych pacjentów chirurgicznych z wysokimi stężeniami końcowowydechowymi sewofluranu, poziomy L-glutaminy, kwasu piroglutaminowego, sfinganiany i L-selenocysteiny były podwyższone w porównaniu z pacjentami z niskimi stężeniami. W naszej populacji jednak stężenia tych metabolitów u kontroli nie były podwyższone, co czyni mało prawdopodobnym wpływ sedacji na metabolom.

Na koniec, ponieważ zastosowaliśmy nietargowane podejście metabolomiczne, nie mogliśmy rozróżnić między związkami izobarycznymi. Na przykład, aldosteron mógłby być zastąpiony przez metabolity mające podobny stosunek m/z, które obejmują kortyzon lub 19-Oic-deoksykortykosteron. Chociaż nie możemy zidentyfikować dokładnego metabolitu, który ma wartość wyróżniającą, oceniliśmy możliwy związek wszystkich związków izobarycznych z chorobą sercowo-naczyniową. Nie doprowadziło to do innych ustaleń i wniosków.

Podsumowując, opisana tutaj obszerna, nietargowana analiza metabolomiczna u dzieci z CHD jest nowatorska i pozwoli na dalsze badania mające na celu rozwikłanie zmienności w odpowiedzi na leczenie. “Chociaż nasze początkowym celem było odróżnienie responderów od nieresponderów, uważamy, że nasze wyniki wskazują, że na podstawie poziomów metabolitów, dzieci z cięższą niewydolnością serca wykazują bardziej wyraźne obniżenie poziomu aldosteronu w odpowiedzi na terapię enalaprilem niż dzieci z mniej ciężką niewydolnością serca” – podsumowują autorzy badania. Ponadto, istniały bardzo wyraźne różnice w profilu metabolicznym między pacjentami a kontrolami, co może pomóc lepiej zrozumieć patobiologię pediatrycznej niewydolności serca związanej z CHD i opracować predykcyjne biomarkery. Ostatecznie, te metabolity mogą być wartościowe pod względem monitorowania progresji choroby.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie działania enalaprilu u dzieci z niewydolnością serca związaną z wrodzonymi wadami serca (CHD). Wykorzystując zaawansowane techniki metabolomiczne, naukowcy zidentyfikowali charakterystyczne profile metaboliczne u pacjentów odpowiadających na terapię enalaprilem. W badaniu wzięło udział 67 pacjentów pediatrycznych, z których 63 zostało sklasyfikowanych jako responderzy (41) lub nieresponderzy (22) na podstawie zmian poziomu aldosteronu. Analiza wykazała znaczące różnice w profilach metabolicznych między tymi grupami oraz między pacjentami a zdrowymi kontrolami. Zaobserwowano, że pacjenci z cięższą niewydolnością serca wykazywali wyraźniejsze obniżenie poziomu aldosteronu w odpowiedzi na terapię enalaprilem. Zidentyfikowane metabolity, w tym kwas oleinowy, arginina i glutamina, mogą służyć jako potencjalne biomarkery odpowiedzi na leczenie oraz progresji choroby. Jest to pierwsze tego typu badanie u dzieci leczonych inhibitorami ACE, otwierające nowe możliwości w zakresie personalizacji terapii i monitorowania postępu choroby.