Czy nowa metoda może zmienić praktykę kliniczną?
Badanie przedstawione w artykule dotyczy opracowania nowej metody analitycznej do oznaczania enalaprilu w próbkach moczu przy użyciu ekstrakcji do fazy stałej na końcówce pipety (PT-SPE) połączonej z elektroforezą kapilarną z detektorem diodowym (CE-DAD). Autorzy przeprowadzili szczegółową optymalizację i walidację metody, co stanowi istotny wkład w rozwój technik analitycznych stosowanych w badaniach farmakologicznych.
Populacja badana obejmowała ochotników, którzy przyjmowali enalapril w dawce 20 mg (Renitec 20 mg). Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Federalnego Uniwersytetu São João del-Rei i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu. Analizowano próbki moczu pobrane od ochotników po doustnym podaniu leku.
Enalapril jest inhibitorem konwertazy angiotensyny stosowanym w leczeniu nadciśnienia tętniczego, niewydolności serca, redukcji proteinurii i przewlekłej choroby nerek. Jest to prolek, który po podaniu doustnym ulega wchłonięciu i hydrolizie do aktywnego metabolitu – enalaprilatu. Mechanizm działania enalaprilu polega na hamowaniu układu renina-angiotensyna-aldosteron, co prowadzi do zmniejszenia tworzenia angiotensyny II, a w konsekwencji do rozszerzenia naczyń obwodowych i zmniejszenia wydzielania aldosteronu. Te dwa mechanizmy przyczyniają się do obniżenia ciśnienia krwi. Enalapril jest szybko wchłaniany po podaniu doustnym, osiągając maksymalne stężenie w osoczu w ciągu 1 godziny, natomiast maksymalne stężenie enalaprilatu występuje 3-4 godziny po podaniu doustnym. Enalaprilat ma okres półtrwania wynoszący 11 godzin, podczas gdy enalapril ma okres półtrwania 1 godziny i jest wydalany głównie przez nerki.
- Połączenie ekstrakcji do fazy stałej na końcówce pipety (PT-SPE) z elektroforezą kapilarną (CE-DAD)
- Wykorzystanie innowacyjnego adsorbentu RA-mPPy-HM-BSA
- Zakres wykrywalności: 100-3000 ng/mL
- Całkowity czas analizy: około 10 minut (2 min przygotowanie + 8 min analiza)
- Skuteczność wykluczania białek: 87%
- Możliwość ponownego użycia adsorbentu do 3 razy
Jakie innowacje stoją za metodami analitycznymi?
Wśród różnych metodologii stosowanych do analizy enalaprilu i jego metabolitów w osoczu, moczu i preparatach farmaceutycznych znajdują się chromatografia gazowa (GC) z detekcją wychwytu elektronów, wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z detekcją spektrometrii masowej (MS) lub tandemowej MS (MS/MS), UHPLC-MS-MS, detekcja UV oraz elektroforeza kapilarna (CE) z detekcją UV. Dla analizy złożonych matryc, takich jak mocz, niezbędny jest proces przygotowania próbki w celu eliminacji potencjalnych interferentów i wstępnego zatężenia analitu. Wśród wielu procedur przygotowania próbek, takich jak wytrącanie białek i metody ekstrakcji rozpuszczalnikowej, podejścia oparte na adsorbentach, jak ekstrakcja do fazy stałej (SPE), zyskały na znaczeniu ze względu na lepszy odzysk analitów, unikanie tworzenia emulsji oraz zmniejszone zużycie odczynników i rozpuszczalników.
W badaniu zastosowano nowatorski adsorbent – mezoporowaty polipirol (mPPy) pokryty podwójnie monomerami hydrofilowymi (HM) i enkapsulowany białkiem (albuminą surowicy bydlęcej, BSA), nazwany RA-mPPy-HM-BSA. Materiał ten został dokładnie scharakteryzowany pod względem właściwości fizykochemicznych przy użyciu różnych technik, w tym skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) oraz analizy powierzchni metodą Brunauera-Emmetta-Tellera (BET).
Co mówią wyniki walidacji i optymalizacji?
Optymalizacja metody PT-SPE obejmowała ocenę różnych parametrów, takich jak objętość próbki, pH próbki, ilość adsorbentu, rozpuszczalnik do przemywania, objętość rozpuszczalnika do przemywania, rozpuszczalnik do elucji oraz objętość rozpuszczalnika do elucji. Najlepsze wyniki uzyskano przy użyciu 40 mg adsorbentu, 750 µL próbki moczu o pH 7, 500 µL heksanu jako rozpuszczalnika do przemywania i 750 µL acetonitrylu jako rozpuszczalnika do elucji.
Walidacja metody PT-SPE/CE-DAD wykazała dobrą liniowość w zakresie stężeń 100-3000 ng/mL, z granicą wykrywalności (LOD) 21,2 ng/mL i granicą oznaczalności (LOQ) 63,6 ng/mL. Metoda charakteryzowała się również dobrą selektywnością, dokładnością i precyzją. Dokładność wewnątrzdzienna wyrażona jako względny błąd procentowy (%RE) wahała się między -4,10% a 2,91%, podczas gdy dokładność międzydzienna wahała się między -4,08% a 3,26%. Precyzja wewnątrzdzienna, wyrażona jako względne odchylenie standardowe (%RSD), mieściła się w zakresie od 0,44% do 1,62%, natomiast precyzja międzydzienna od 1,09% do 2,21%. Odzysk enalaprilu wynosił około 74%, co jest wartością akceptowalną dla analizy złożonych matryc biologicznych.
Test wykluczania białek wykazał, że RA-mPPy-HM-BSA wykluczał 87% białek, co było lepszym wynikiem niż w przypadku mPPy (70%) i RA-mPPy-HM (80%). Wskazuje to, że podwójne powlekanie materiału znacznie poprawiło jego zdolność do wykluczania makrocząsteczek obecnych w matrycach biologicznych. Badanie możliwości ponownego użycia adsorbentu wykazało, że może on być stosowany do trzech kolejnych ekstrakcji bez istotnej utraty wydajności.
- Wysoka dokładność i precyzja pomiarów
- Przyjazność dla środowiska potwierdzona pięcioma wskaźnikami ekologicznymi
- Ekonomiczność i szybkość wykonania
- Skuteczne monitorowanie stężenia enalaprilu w moczu pacjentów
- Możliwość optymalizacji terapii dla pacjentów z nadciśnieniem tętniczym
- Szczególnie przydatna w monitorowaniu grup wysokiego ryzyka
Jakie zastosowanie kliniczne ma ta metoda?
Metoda została z powodzeniem zastosowana do oznaczania enalaprilu w próbkach moczu pobranych od ochotników 1 i 2 godziny po podaniu leku. Stężenia enalaprilu wynosiły 126,35 ng/mL w pierwszej godzinie i 285,13 ng/mL w drugiej godzinie. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami opisanymi w literaturze.
W porównaniu z innymi metodami opisanymi w literaturze, opracowana metoda PT-SPE/CE-DAD wykazuje kilka istotnych zalet: jest ekonomiczna, wykorzystuje wysoce wydajny adsorbent, jest szybka i efektywna (przygotowanie próbki trwa około 2 minut, a analiza CE-DAD około 8 minut), oraz jest przyjazna dla środowiska. Ekologiczność metody została oceniona przy użyciu pięciu różnych wskaźników: AGREE (Analytical Greenness), AGREEprep (Analytical Greenness metric for sample preparation), SPMS (sample preparation metric of sustainability), BAGI (blue applicability grade index) i ComplexMoGAPI (Green Analytical Procedure Index), które potwierdziły jej niski wpływ na środowisko. W ocenie AGREE metoda uzyskała wynik 0,67, w AGREEprep 0,59, w SPMS 6,95, w BAGI 60, a w ComplexMoGAPI 84, co wskazuje na dobry profil ekologiczny.
Opracowana metoda stanowi cenne narzędzie do monitorowania stężenia enalaprilu w moczu pacjentów, co może być przydatne w praktyce klinicznej do optymalizacji terapii i monitorowania grup wysokiego ryzyka. Metoda jest szybka, dokładna i przyjazna dla środowiska, co czyni ją atrakcyjną alternatywą dla istniejących technik analitycznych.
Podsumowanie
Przedstawione badanie opisuje nową metodę analityczną do oznaczania enalaprilu w próbkach moczu, wykorzystującą ekstrakcję do fazy stałej na końcówce pipety w połączeniu z elektroforezą kapilarną. Metoda została zoptymalizowana i zwalidowana, wykazując wysoką skuteczność w zakresie stężeń 100-3000 ng/mL, z dobrą selektywnością i precyzją. Wykorzystano nowatorski adsorbent RA-mPPy-HM-BSA, który skutecznie wyklucza białka z próbek biologicznych. Technika jest szybka (całkowity czas analizy około 10 minut), dokładna i przyjazna dla środowiska, co potwierdzają wysokie wyniki w różnych wskaźnikach ekologicznych. Metoda została skutecznie zastosowana w badaniach klinicznych do monitorowania stężenia enalaprilu w moczu pacjentów, oferując potencjalne zastosowanie w optymalizacji terapii i monitorowaniu pacjentów wysokiego ryzyka.
